Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Селективность базы данных, которая позволяет положительно идентифицировать данный материал либо достоверно отличить его от других материалов, содержащихся в базе данных, должна быть установлена во время процедуры валидации. Для уверенности в пригодности базы данных эта селективность должна регулярно проверяться; в особенности это необходимо делать после любых значительных изменений, произошедших с веществом (например, изменение поставщика или производственного процесса), либо при настройке прибора для рамановской спектрометрии (например, при подтверждении шкалы волновых чисел или воспроизводимости отклика спектрометра)
База данных пригодна только для исходного прибора, либо для подобного прибора при условии определения того, что перенесенная на прибор база данных остаётся пригодной.
Метод. Подготовку и исследование образца проводят таким же образом, как и при создании базы данных. Для облегчения сравнения спектров и количественных расчётов могут быть использованы подходящие математические преобразования рамановских спектров.
Сравнение или преобразования спектров, количественный прогноз свойств веществ, находящихся в исследуемом материале, могут проводиться с использованием подходящих методов хемометрики, статистической классификации и градуировки.
2.2.54. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ, IEF) - это вариант электрофореза, в котором разделение белков происходит в соответствии с их изоэлектрическими точками. Разделение проводится на пластине из полиакриламида или агарозного геля, содержащего смесь амфотерных электролитов (амфолитов). При действии электрического поля амфолиты мигрируют в геле, создавая градиент рН. В некоторых случаях используют гели, имеющие фиксированный градиент рН, полученные путём включения слабых кислот или оснований в определённые места
геля во время его приготовления. Когда нанесённые белки достигают фракции геля, которая имеет такое же значение рН, что и их изоэлектрическая точка (pI), заряд данных белков нейтрализуется и миграция прекращается. Градиенты могут быть созданы в различных диапазонах рН в зависимости от выбранной смеси амфолитов.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
В изоэлектрической точке молекула белка незаряжена и не может передвигаться в матрице геля под действием электрического поля. Её перемещение, однако, может происходить в результате диффузии. Градиент рН вынуждает белок оставаться в изоэлектрическом состоянии, концентрируя данное вещество. Такое концентрирование называется «фокусирование». Увеличение приложенного напряжения или уменьшение количества нанесённого вещества улучшает разделение полос. Величина приложенного напряжения ограничена выделяющейся теплотой, которая должна быть рассеяна. Использование тонких слоёв геля, а также пластин с эффективным охлаждением, контролируемых термостатирующим устройством, предотвращает возгорание геля и в тоже время обеспечивает точное фокусирование. Разделение оценивают по минимальной разности pI (Dpi), которая необходима для разделения двух соседних полос:
D(dpH : dx)
E(-dm : dpH)
Dpi = 3 • где:
D - коэффициент диффузии белка,
dpH
-------градиент рН,
dx
E - напряжённость электрического поля, в вольтах на сантиметр, dm
--------- изменение подвижности вещества при изменение рН в диапазоне рН
dpH
близком к pI.
dm
Поскольку D и--------для определённого белка не могут быть изменены, улучшить
dpH
разделение можно при использовании более узкого диапазона рН либо при увеличении напряжённости электрического поля.
Разрешение между полосами белков в случае использования ИЭФ-геля, содержащего ведущие амфолиты, достаточно хорошее. Улучшить разрешение можно при использовании фиксированных градиентов рН, для создания которых применяются буферные вещества, аналогичные ведущим электролитам, сополимеризованные с матрицей геля. При использовании геля, содержащего ведущие электролиты, могут быть разделены белки, значения pI которых отличаются на 0,02 единицы pH, в то время как фиксированные градиенты рН позволяют разделить белки, изоэлектрические точки которых различаются приблизительно на 0,001 pH.
ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Следует уделять особое внимание характеристикам и/или подготовке образца. Наличие солей в образце может вызвать ряд проблем, поэтому лучше
всего при приготовлении образца использовать деионизированную воду или 2%-ный раствор амфолитов, используя при необходимости диализ или гель-фильтрацию.
Время, необходимое для завершения фокусирования в тонком слое полиакриламидных гелей, определяют путём нанесения окрашенного белка (например, гемоглобина) в различные области поверхности геля и применения электрического поля: стабильное состояние достигается тогда, когда все нанесения дают идентичный образец полос.
В некоторых протоколах о завершении фокусирования судят по времени, прошедшему после нанесения образца.
ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на идентичность, В этом случае исследуемый образец, мигрирующий на геле, сравнивается с подходящим стандартным образцом и ИЭФ-градуировочными белками. ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на предельное содержание. При этом плотность полосы на ИЭФ сравнивается соответственно с полосой на ИЭФ, появляющейся при использовании стандартного образца. Если плотность измеряют с помощью денситометра или аналогичного устройства, позволяющего определить относительную концентрацию белка в полосе. ИЭФ может быть также использовано при испытании на количественное содержание белков.
